Ihr Debüt hatte die forensische DNA-Analyse 1986 in England - ein Jahr nach Jeffreys' Publikation mit einer Rasterfahndung in Leicestershire. Dort war ein 15jähriges Mädchen vergewaltigt und ermordet worden, drei Jahre zuvor eine Gleichaltrige. Bei beiden Opfern fanden sich Spermaspuren. Die britische Polizei bat 5000 Männer der Region zur Blutprobe. Einer gab zweimal Blut ab, aber unter verschiedenen Namen um einen Arbeitskollegen zu decken. Dessen DNA-Profil stimmte mit dem der Spermaspuren überein. Er gestand beide Morde. Ein bereits unschuldig Inhaftierter kam frei.
Ein spektakulärer Fall in Deutschland machte den genetischen Fingerabdruck auch hier bekannt: Im Fall Christina Nytsch (11) hatte man am Opfer Spermaspuren gefunden und suchte über einen Speicheltest nach dem passenden genetischen Muster des Täters. 1998 wurden ca. 12.000 Männer zwischen 18 und 30 Jahren aus allen Nachbardörfern zum Speicheltest gebeten (- unter ihnen auch der dadurch überführte Mörder).

Seit 1998 wird beim Bundeskriminalamt (BKA) eine DNA-Datei aufgebaut. In ihr sollen die genetischen Fingerabdrücke bestimmter Tätergruppen auf Verdacht gespeichert werden. Seit der schnellen Aufklärung des Mordfalles Moshammer wird in Politik und Medien diskutiert, ob diese Art der Spurensuche auf alle Felder der Kriminalität ausgeweitet werden soll. Bislang ist ein DNA -Fingerabdruck nur bei schweren Straftaten und mit richterlicher Genehmigung möglich.
Inzwischen dürfen bei 41 verschiedenen Straftatbeständen DNA-Daten gespeichert werden, angefangen von Sexualdelikten bis zu Brandstiftung, Wohnungseinbruch, Diebstahl, Bildung terroristischer Vereinigungen, Erpressung und Körperverletzung im Amt.

Die rapide wachsende DNA-Datei des BKA weist inzwischen eine beeindruckende Trefferquote auf – fast jede vierte Anfrage führt zum Erfolg. Etwa 382.000 Datensätze (Stand 30. November 2004) sind dort gespeichert, rund 340 Tötungsdelikte, 820 Sexualstraftaten und mehr als 21.000 Diebstähle konnten mit Hilfe der Datenbank aufgeklärt werden. Allein 2002 hat die BKA-Datenbank geholfen, dass 66 Fälle von Mord und Totschlag, 135 Sexualverbrechen, 250 Raubüberfälle, Erpressungen und mehr als 3000 andere Eigentumsdelikte aufgeklärt werden konnten.

b) Wenn nur eine winzige Menge DNA vorliegt: (Benötigt werden nur wenige Zellkerne, das entspricht ca. 1milliardstel Gramm DNA)

    Das PCR-Verfahren: DNA-Vervielfachung durch die Polymerase-Kettenreaktion
 

Diese VNTR-Loci werden durch spezifische Schneide-Enzyme = Restriktionsenzyme als "Schnipsel" = DNA- Fragmente verschiedener Länge herausgeschnitten. Um sie der Länge nach zu sortieren und um sie sichtbar zu machen müssen noch eine Reihe weiterer Schritte folgen. (siehe unten)

• Der hier beschriebene Schulversuch simuliert die RFLP (Restriktions- Fragment- Längen- Polymorphismus)- Methode. Es soll der genetische Fingerabdruck von fünf DNA-Proben (für einen VNTR-Locus) verglichen werden.
• Eine dieser Proben soll direkt vom "Tatort" d.h. "Täter" stammen, vier weitere DNA-Proben sollen "Verdächtigen" entnommen worden sein. Diese Proben könnten aus Mundschleimhautzellen, Körperflüssigkeiten (Blut, Sperma), Haarwurzelzellen oder sogar aus mumifiziertem Gewebe von Fossilien gewonnen werden.
• Statt menschlicher DNA nehmen wir (harmlose) Bakterien-DNA, und zwar vier verschiedene DNA-  Plasmide, die jeweils einen "Verdächtigen" repräsentieren sollen.

Jedes Plasmid wird mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen in charakteristische DNA-Fragmente zerlegt, durch Gelelektrophorese werden die DNA-Fragmente der Länge nach sortiert und mit einem Farbstoff sichtbar gemacht.
Durch Vergleich der vier erhaltenen Bandenmuster der "Verdächtigen"- Plasmide mit dem Bandenmuster des "Tatort"-Plasmids lässt sich dann einer der "Verdächtigen" als Spurenleger d.h. "Täter" überführen.

Arbeitsschritte:

Material:

Erläuterungen:

A)

Restriktions-

spaltung

der Plasmide

Erkennungssequenz:   

B)

 Gel- 

elektrophorese

C) 
Färbung

     Thermoblock auf 37Grad vorheizen (s.A5)

Kühl halten bis zum Gebrauch!

A2) Stellen Sie ebenfalls 5 leere Eppendorf-Gefäße bereit und beschriften Sie diese wasserfest mit A, B, C, D, und Tatort.

20µl Gesamtvolumen

Hinweise zum Pipettieren:
 - Pipetten nie an der Spitze anfassen.

 - Pipettenspitze bei Wechsel der Substanz immer wegwerfen.

 - Werden mehrere Substanzen in ein  Eppendorf-Gefäß pipettiert, nicht mit der Pipettenspitze in den vorigen Tropfen tauchen. Zur Sicherheit durch kurzes Zentrifugieren den Tropfen auf den Gefäß-Boden treiben.

 - Der letzte Tropfen Lösung in der Spitze der Mikropipette wird dadurch entfernt, dass die Innenwand des Gefäßes mit der Pipettenspitze berührt wird.

B1)

Herstellung 

des

Agarose-Gels

Achtung: A.6 nicht vergessen!

B2)

Auftragen der

 Proben

B3)

 Elektrophorese

In einem Mordfall in Arizona wurde zum ersten Mal in der Justizgeschichte der DNA-Fingerabdruck einer Pflanze benötigt.
Im Auto eines Verdächtigen fand man zwei Samen des Palo-Verde-Baumes, einer Baumart, die auch am Tatort gefunden wurde. Der Verdächtige bestritt, je am Tatort gewesen zu sein. Durch Vergleich der auch bei Pflanzen vorkommenden hochvariablen VNTRs konnte der Same einem bestimmten Baum in der Einfahrt zum Tatort zugeordnet werden.

Experiment:  DNA-Fingerabdruck

Arbeitsschritt

Restriktionsspaltung
der Plasmide

Pipettieren

15'

A5) 

Schneiden der DNA

60'

Gelelektrophorese

B1) 

Herstellung des Agarose-Gels

B2) 

Auftragen der DNA-Fragmente

15'

B3)

Elektrophorese

40'

Färben/Entfärben

C)

Anfärben der DNA-Banden

15'

Herauswaschen der Hintergrundfärbung

20'

Auswertung

D)

10'

                                                                      Gesamtdauer:

ca. 3h

Da die Sequenz und Struktur eines jeden Proteins durch eine spezifische kodierende DNA-Sequenz festgelegt wird, können auch Protein-Fingerprints letzlich Aussagen über die genetische Ausstattung einer Art machen. Ähnlich wie beim DNA-Fingerprinting kann man durch Protein-Fingerprinting also evolutionäre Verwandtschaftsverhältnisse beschreiben.
Um z.B. Lachs, Forelle, Stör, Wels und Zander zu unterscheiden, muss man die verschiedenen Fischmuskelfleisch-Proben in ihrem Proteinmuster vergleichen. Muskel-Protein besteht überwiegend aus den Proteinen Actin und Myosin - diese Proteinausstattung ist also bei den verschiedenen Fischarten sehr ähnlich. Viele andere Muskelproteine sind jedoch selbst bei eng verwandten Arten sehr verschieden und dienen in unserem Versuch als arttypischer Protein-Fingerabdruck.
Wie beim DNA-Fingerabdruck wird wieder eine Sortierung nach der Molekülgröße vorgenommen. Man lässt die Proteinmoleküle  -unzerschnitten, aber hitzedenaturiert- in einem elektrischen Feld durch die Poren eines Gels wandern, und erhält wie bei der DNA ein charakteristisches Bandenmuster.
in diesem Fall handelt es sich um ein SDS-Polyacrylamid-Gel.  Es trennt, ähnlich wie ein Agarose-Gel Proteingemische nach Molekülgröße. 
Die von verschiedenen Fleischsorten (z.B. Rind, Schwein, Pute) oder Fleischgemischen (z.B. Lyoner, Salami) erhaltenen Protein-Fingerprints werden anhand von bestimmten typischen Banden z.B. als Rindfleisch identifiziert.

Bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Gemische verschiedener Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die Proteinproben werden durch Zugabe des starken Detergens (=Seife) SDS (Natriumdodecylsulfat) und ß-Mercaptoethanol (=Reduktionsmittel) und anschließendes Erhitzen  (95^oC) denaturiert. Alle Proteine liegen im Anschluss an diese Denaturierung in einer ähnlichen, stäbchenartigen Form vor und sind durch das SDS stark negativ geladen. Das ß-Mercaptoethanol reduziert, d.h. spaltet eventuell vorhandene Disulfidbrücken innerhalb oder zwischen den Molekülen.

Legt man nach Auftrag der Proben auf das Gel ein elektrisches Feld an, wandern die Proteine zur Anode (+). Die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine hängt dabei fast nur von ihrem Molekulargewicht ab; ihre Eigenladung ist durch das SDS völlig überdeckt. Das SDS-PAGE kann man sich als eine Art Molekularsieb vorstellen, das aus langen Polymeren des Acrylamids besteht und durch Bisacrylamid quervernetzt wurde. Größere Proteine werden im Geflecht stärker zurückgehalten, wandern also langsamer.
Die zu untersuchende Proteinprobe wird mit Laemmli-Puffer versetzt, der neben ß-Mercaptoethanol und SDS noch Bromphenolblau enthält, das den Fortlauf der Elektrophorese anzeigt. Bromphenolblau wandert aufgrund seiner physikalischen Eigenschaften immer vor der Proteinfront. Glycerin als weiterer Bestandteil sorgt durch seine hohe Dichte für einen einfachen Probenauftrag auf das Gel.
Trägt man parallel zur Proteinprobe einen Molekulargewichtsstandard (Proteinmarker) mit Proteinen bekannter Molekulargewichte auf, kann man über einen Bandenvergleich Molekulargewichte in der Probe grob abschätzen.

SDS-PAGE werden oft angewandt, um Ergebnisse biochemischer Protein-Experimente auswerten zu können oder auch um die Reinheit isolierter Proteine überprüfen zu können.
Um die Trennung der Proteinmoleküle zu verbessern, wird mit 2 verschieden großen Porengrößen im Gel gearbeitet: Sammelgel und Trenngel. (s.Durchführung)

Rotiphorese Gel Fertig-Lösung (Acrylamid)

SDS-Lösung 10%   (Sodiumdodecylsulfat)

dest. Wasser  

APS-Lösung 10% (Ammoniumperoxodisulfat): Starter

TEMED (Tetramethylethylendiamin) Radikalbildner 

Rotiphorese Gel 30 Lösung (Acrylamid)

830µL

APS-Lösung 10% (Ammoniumperoxodisulfat) : Starter

TEMED(Tetramethylethylendiamin) Radikalbildner

Zur Vorbereitung der Proben sollten Einmalhandschuhe getragen werden, da die Eppendorf-Gefäße durch die Hitze aufspringen können! 
Am besten während der Inkubation bei 95 °C den Thermoblock mit einem Gewicht beschweren. Wenn man die Proben dann nach 10 min in ihrem Gestell und mit Gewicht vom Thermoblock abnimmt, kann man sie kurz abkühlen lassen.

4) Dieser Überstand mit dem denaturierten Proteingemisch wird weiterverwendet für die Gel- Elektrophorese. ( Bei Bedarf könnten die Proben jetzt zur Aufbewahrung eingefroren werden)

Gießen des Gels: Eine Glasplatte mit integrierten Abstandhalter (0.75 mm) und eine plane Glasplatte werden mit Ethanol und einem weichen Papiertuch gereinigt. Die beiden Glasplatten (kurze Platte und Platte mit aufgeklebten Abstandhaltern) werden so zusammengesetzt, dass zwischen den Platten ein flacher Hohlraum entsteht. Die beiden Platten werden zusammen als Gelkassette in den grünen Gelrahmen eingesetzt, so dass die kürzere Platte - wie auf dem Bild zu sehen - nach vorne zeigt: Die beiden Hebel des Gel-Rahmens werden nach außen gedrückt: Der Gelrahmen wird anschließend in den Gießstand eingesetzt, indem die Klammer am oberen Rand der Apparatur gedrückt wird. Durch die Klammer werden die Platten gegen die untere graue Gummileiste gedrückt und damit nach unten abgedichtet. Mit einem wasserdichten Filzschreiber wird ca. 1 cm unterhalb der oberen Glasplattenkante eine Markierung angebracht, um die Trenngelhöhe festzulegen.

5 mL der vorbereiteten Trenngellösung wird mit 30 µl der 10%igen APS-Lösung sowie 3 µl TEMED versetzt und zügig mit der 1000µl -Pipette in den Hohlraum zwischen die beiden Glasplatten pipettiert bis das Flüssigkeitsniveau bis zur Markierung angestiegen ist. Anschließend wird zu Glättung mit Isopropanol überschichtet (ca. 5 mm hoch). Nach ca. 10 bis 15 min ist das Trenngel polymerisiert. Das Isopropanol wird weggegossen, die Oberfläche vorsichtig mit dest. Wasser gespült und mit einem Filterpapier getrocknet.

Alle Bestandteile der Apparatur werden in umgekehrter Reihenfolge wieder auseinandergenommen, bis man die Gelkassette mit dem SDS-Gel vor sich liegen hat. Diese wird unter Zuhilfenahme eines Spatels oder grünen Keils von BioRad vorsichtig aufgehebelt und das Gel in die Coomassie-Färbelösung (ca.100 mL) überführt. Nachdem die Lösung in der Mikrowelle auf ca. 80^oC gebracht wurde, wird für ca. 20 min unter ständigem Schwenken gefärbt. 

2) Coomassie-Entfärbelösung:
Anschließend wird der Färber in das Vorratsgefäß zurückgegossen und das Gel mit 100 mL Entfärber erneut in der Mikrowelle erwärmt. Nach ca. 30 - 60 min ist das Ergebnis der SDS-PAGE auf einem Leuchttisch (Tageslichtprojektor) zu erkennen. Ein Austausch der Entfärbelösung gegen frischen Entfärber beschleunigt den Entfärbevorgang.

Man erkennt, dass jede Fleischart (Pute, Rind, Schwein) ein ganz charakteristisches Muster an Proteinbanden zeigt. Bestimmte Banden kommen nur in einer der untersuchten Fleischsorten vor und können so auch zur Identifikation von Fleischsorten dienen (s. "unbekannte Probe). Auch in Fleischgemischen lässt sich so die Frage beantworten, ob z.B. Rindfleisch enthalten ist. (Vgl. auch Text in der Einleitung zu diesem Versuch)

Lernvoraussetzungen:
Aufbau und Funktion von Proteinen, Proteinbiosynthese,

Sicherheit:
Unpolymerisiertes Acrylamid ist giftig! Schutzhandschuhe, Schutzbrille

Experiment:  SDS-PAGE

                                 Arbeitsschritt

Proteindenaturierung

 A1) - A2)

Pipettieren, Inkubieren

15'

A3) - A4)

Zentrifugieren, Pipettieren

5'

Gelelektrophorese

B1) - B2)

Herstellung des Polyacrylamid-Gels

45'

B3) 

Auftragen der Protein-Proben

15'

B4)

Elektrophorese

60'

Färben/Entfärben

C1) - C3)

Anfärben der Protein-Banden

20'

Herauswaschen der Hintergrundfärbung

30'

Archivierung

Auswertung

D)

5'

                                                                      Gesamtdauer:

ca. 3,5h